پایان نامه استخراج و شناسایی ترکیبات طبیعی موجود در کبد و بافت عضله ماهی کفشک زبان گاوی (Largescale tonguesole)

پایان نامه کارشناسی ارشد  

 گرایش : غیر زیستی

چکیده :

در این تحقیق مواد طبیعی و اسید های چرب موجود در بافت کبد و عضله ماهی کفشک زبان largescale tonguesole با نام علمی  (cynoglossus macrolepidotus ) معروف به زبان گاوی با استفاده از روش(bligh and dyer ) استخراج گردید .

برای شناسایی این مواد ابتدا کلروفرم که به عنوان حلال مورد استفاده قرار گرفته بود توسط دستگاه rotary evaporator تبخیر و سپس مواد در –n هگزان حل گردید و به دستگاه GC-MS تزریق شد . با استفاده از کروماتوگرام جرمی و طیف های جرمی بدست آمده مواد طبیعی موجود از جمله اسیدهای چرب بافت کبد و عضله با محاسبه اندیس کواتس و مقایسه آنها با اندیس کواتس استاندارد و نیز بررسی داده های طیفی ( GC-MS ) و مقایسه آنها با داده های استاندارد موجود در مراجع (Eight peak ) شناسایی گردید .

در کبد یازده ترکیب شناسایی شد که  palmitic acid با 98/14 درصد بیشترین مقدار می باشد . سایر ترکیبات شناسایی شده در کبد شامل oleic acid (30/12درصد) ،
 1,3-cyclooctadiene(97/7درصد)stearicAcidو(80/6)درصد، methyl eicosa-5,8,11,14,17 pentaenoate   (45/6 درصد) ،  1,4,8-dodecatiene (75/5 درصد). 9-hexadecanoic acid (39/5درصد)ethyl ester، 5,8,11,14-eicosatetranenoic acid (08/4درصد)،heptacosane (77/1درصد)،3-heptadecan-5-yne (24/1درصد)،myristic acid (66/0درصد)می باشد . ترکیبات شناسایی شده در بافت عضله شامل plamitic acid (15/43درصد) ، methyl eicosa-5,8,11,14,17-pentanoate  (51/23درصد) ،stearic acid (35/8درصد)،oleic acid(68/0درصد)،nonane(74/6درصد)، decane(06/3درصد) می باشد .

واژگان کلیدی : اسیدهای چرب غیر اشباع،روغن کبد و عضله ماهی، کفشک زبان گاوی،پالمتیک اسید، اولئیک اسید

مقدمه :

اسیدهای چرب اشباع نشده با چند پیوند دو گانه (PUFA)poly unsturated fatty acids  از نوع اسید های چرب Omega-3 و اسیدهای چرب Omega-6 جزو اسیدهای چرب  ضروری برای بدن انسان هستند که بدن انسان توانایی ساخت این اسیدهای چرب اشباع نشده  را ندارد و باید از طریق مواد غذایی تامین گردد .

 اسیدهای چرب  Omega-3 بیشتر در بدن  ماهی و بخصوص ماهی های  روغنی  مثل شاه  ماهی،ماهی خال مخالی، ساردین ، پلیچارد، ماهی آزاد و ماکرل یافت می شود .

اسیدهای چرب امگا 3 شامل (ALA) Alpha – linolenic acid و دو مشتق آن با اسامی Decosahexaenoic acid (DHA) و  Eicosapentaenoic acid (EPA)
می باشند .

 در بدن ماهی ALA از طریق فعل و انفعالات بیوشیمیایی به EPA , DHA تبدیل می گردد . مشابه همین امر در بدن انسان نیز رخ می دهد اما آنچه حائز اهمیت است این است که ALA در بدن وجود نداشته و ساخته نمی شود ، بنابراین بایستی از طریق مواد غذایی(مثل ماهی و روغن ماهی که یکی از منابع سرشار اسیدهای چرب امگا 3 است ) به بدن برسد و همین نکته نشانگر ضرورت مصرف ماهی و غذاهای دریایی می باشد . [12] .

 DHA برای عملکرد مغز، چشم و سیستم تولید مثل پستانداران ضروری است و تحقیقات اخیر نشان می دهد که وجود آن به میزان کافی در بدن باعث تعادل خلق و داشتن روحیه مثبت
 می گردد .

EPA برای ساخته شدن پروستاگلایدینهای ضروری برای عملکرد صحیح سیستم قلب و عروق حیاتی هستند و در ساختمان غشای سلولی نیز شرکت می کنند.

 اسیدهای چرب غیراشباع امگا 6 در روغن های گیاهی مثل روغن آفتابگردان، روغن کنجد و روغن ذرت ، سویا و .. یافت می شود [25] .

اسیدهای چرب امگا 3 با زنجیر کوتاه به نام اسید آلفا لینولینک در روغن های گیاهی خاصی مثل روغن برزک ، روغن کلزا (کانولا) و روغن گردو یافت می شود[31].

 اگر چه برخی از دانشمندان معتقدند بدن انسان مقادیری از امگا 3 موجود در روغن های گیاهی را نیاز دارد[21] .

ماهی یک منبع مهم است . گوشت ماهی منبع مهم پروتئینی و چربی به شمار می رود و در مقایسه با سایر گوشت ها هضم راحتی دارد . روغن ماهی غنی از ویتامین های D,A بوده و کبد ماهی یک منبع عظیم از ویتامین هاست . خوردن دو تا سه وعده ماهی در غذای هفتگی بسیار موثر است .

برای استخراج چربی ها و از جمله اسیدهای چرب از بافت های موجودات روش های مختلفی وجود دارد که از جمله آن ها می توان به روش استخراچ لیپیدها با مخلوطی از هگزان و ایزوپروپانول ، روش ستون خشک ، روش bligh and Dyer و ... اشاره کرد .

در این پژوهش از روش bligh and Dyer استفاده گردیده است [20] .

هدف از انجام این بررسی گامی درجهت شناخت ترکیبات طبیعی موجود در بافت عضله وکبد گونه ای از ماهیان خلیج فارس بنام ماهی کفشک زبان با نام محلی زبان گاوی و نام انگلیسی (largescale tonguesole) بوده است .

فصل اول

کلیات

1-1 هدف

در سالهای اخیر تحقیقات وسیعی در مورد اثر تبلیغات استفاده از ماهی و روغن ماهی انجام گرفته است .

نتیجه این مطالعات اثرات مفید آن را در بهبود و یا پیشگیری از بسیاری از  بیماریها و نارسایی ها اثبات می کند .

این اثرات مثبت به دلیل وجود اسیدهای چرب اشباع نشده با چند پیوند دو گانه PUFA-(poly unsaturated fatty acdis) از نوع اسیدهای چرب امگا 3 و اسیدهای چرب امگا 6 در ماهی می باشد .

این اسیدها جزو اسیدهای چرب ضروری برای بدن انسان هستند که بدن انسان توانایی ساخت این اسیدهای چرب اشباع نشده را ندارد و باید از طریق مواد غذایی (مصرف ماهی و آبزیان ) تامین گردند .

از فواید و خواص ماهی و روغن ماهی می توان به موارد زیر اشاره کرد :

پیشگیری از بروز بیماری های قلبی و عروقی

افزایش تمرکز و یادگیری

اثرات مفید بر سیستم مغز و اعصاب

اثرات مثبت در افراد مبتلا به سرطان

کاهش ابتلا به بیماریهای التهابی مانند آرتریت روماتویید، آسم،پسوریازیس،اگزما،انواع آلرژی ها و...

کاهش سردردهای عروقی و بیماری های کلیوی

کاهش خطر سکته مغزی ، قلبی و انسداد رگ ها

کاهش درد و سختی مفاصل در بیماریهای رماتیسم مفصلی

درمان خشکی چشم

کمک به کاهش وزن بدن(امگا 3 باعث بهبود بخشیدن به عملکرد تک تک سلولهای بدن می شود . )

کمک به گردش خون و ممانعت از لختگی خون در رگ ها

با تحریک تشکیل کلاژن موجب شادابی پوست می شود.

اثرات مثبت روی سلولهایی که بوسیله نیکوتین در افراد سیگاری از بین می روند .

کاهش افسردگی در افراد

افزایش قدرت سیستم دفاعی بدن و...

تمامی عوامل ذکر شده و رشته تحصیلی ، نگارنده را بر آن داشت که پژوهش حاضر را در راستای شناسایی مواد طبیعی موجود در کبد و بافت عضله ماهی کفشک زبان گاوی (Cynoglossus macrolepidotus) را به انجام رساند تا از این طریق سهم کوچکی در تضمین سلامتی هموطنان خود داشته باشد .

1-2 پیشینه تحقیق

روغن ماهی منبع سرشاری از اسیدهای چرب غیر اشباع(PufA) و ویتامین های محلول در چربی است و دارای خواص دارویی و صنعتی قابل توجهی می باشد . کاربردهای این روغن تا قبل از سال 1956 میلادی بیشتر در موارد صنعتی از قبیل صنایع چرم ، صابون ، رنگ ، مارگارین و... بوده است ولی از آن زمان به بعد با پی بردن به ارزش دارویی روغن ماهی تحقیقات وسیعی در زمینه آن انجام گرفته است . وجود اسیدهای چرب غیراشباع به خصوص از خانواده -3 و ویتامین های محلول در آن باعث شده که این روغن نقش مهمی در درمان بیماریهای قلبی و بعضی از سرطان ها ، درد مفاصل ، آسم و... و به طور کلی افزایش سیستم دفاعی بدن در مقابل بیماریها داشته باشد .

در سال 1958، مطالعات Zutphen اولین سری مطالعاتی بود که رابطه معکوس بین مصرف ماهی و بیماری های قلبی را نشان داد . [33]

Gurr در سال 1993 در انگلستان به بررسی توصیفی تاثیر اسیدهای چرب -3روی چربی های خون پرداخته است . مهمترین تاثیر اسیدهای چرب -3 روغن ماهی ، کاهش دادن VLDL پلاسما می باشد . چون این ذرات غنی از تری گلیسیرید هستند بنابراین تاثیرعمده اسیدهای چرب ---3 روی کاهش غلظت تری گلیسیرید پلاسما می باشد .(Gurr,M.,1993)

بسیاری از مطالعات دیگر نشان داده اند که مصرف متوسط PUFA از نوع n-3 مقدار تری گلیسیرید پلاسمای بیماران و افراد سالم را پایین می آورد . همچنین تحقیقات نشان داده اند که رژیم غذایی سرشار از MUFA که در روغن ماهی فراوان یافت می شود مقدار کلسترول تام و کلسترول LDL پلاسما را کاهش می دهد اما موجب کاهش HDL نمی شود (Gurr,M.,1993) .

اسیدهای چرب ضروری (EFAS) شناخته شده ترین ترکیبات مفید برای بیماریهای قلبی – عروقی است . در نوامبر 2002، انجمن قلب آمریکا توصیه هایی در خصوص سلامتی بزرگسالانی که حداقل هفته ای دوبار ماهی می خورند ( بخصوص ماهی حاوی مقادیر زیاد DHA,EPA) ، منتشر نمود.[34]  

  بیشترین توجه روی اسیدهای چرب ، ناشی از مطالعات انجام گرفته در سال 1975 بر روی اسکیموهای گرینلند بود . محققین مغایرت مصرف زیاد چربی در رژیم غذایی اسکیموها و پایین بودن نرخ بیماریهای قلبی- عروقی را کشف کردند (Dyerberg,J.,et al.,1987) در بررسی  و تحقیق انجام گرفته در سال 2001، محققان دریافته اند که جایگزین نمودن 10% از چربی اشباع شده در رژیم غذایی موش صحرایی با روغن گل گاو زبان و روغن نوعی پامچال وحشی(Epo)، اثرات بازدارنده در افزایش کلسترول کل و غلظت کلسترول LDL دارد

 ( Fukushima,M.,et al.,2001) .

مطالعات دیگر نشان داده است که مصرف روغن ماهی در کاهش بیماری فشار خون به ویژه در بزرگسالان موثر می باشد . [35]

مقادیر کم اسید چرب امگا-3 در درمان بیماری افسردگی بکار می رود. طی بررسی بعمل آمده در سال 2002، محققین دریافتند که با مصرف یک گرم در روز EPA، افسردگی طویل المدت بیماران بهبود می یابد . [36]

عوارض پوستی نظیر اگزما، التهابات پوستی نشان داده اند که با اسیدهای چرب ضروری (EFA) ، به ویژه GLA ( گامالینولینگ اسید) قابل درمان هستند .[37]

 مکانیسم عمل GLA در جهت کمک به عوارض پوستی ناشناخته است . تحقیقات انجام گرفته در دانشگاه Inha کشور کره ؛ روشن ساخت که استفاده از Epo (روغن ماهی پامچال وحشی) التهاب و زخم های پوستی را بهبود می دهد . لذا محققین به این نتیجه رسیدند که ماده GLA موجود در EPO احتمالا با سیستم ایمنی بدن در ارتباط است . (Yoon,s., et al.,2002) .

امگا-3 در معالجه بیماران روانی نیز بسیار موثر است . محقیقن در تحقیقات دیگر به این نتیجه رسیده اند که LCPUFAs ( اسیدهای چرب اشباع نشده با زنجیر طولانی) برای رشد و پیشرفت کودکان نیز ضرروی است . حتی در بزرگسالان تحقیقات کلینیکی نشان داده است که Lcpufas در جلوگیری از خونریزی مغزی ، حفاظت و سلامت بیشتر مغز و بزرگتر شدن آن دخالت دارد . (lavque,E.,etal.,2002) .

غیر از EFAs ( اسیدهای چرب ضروری)، چربی های دیگری نیز هستند که برای سلامتی انسان مفیدند . CLA(اسیدهای لینولئیک مزدوج) از نظر ساختاری شبیه به لینولئیک اسید (LA)  از خانواده امگا-6 است ، اگر چه CLA دو پیوند دوگانه دارد که در موقعیت های مختلفی قرار دارند . LA دو پیوند دوگانه در موقعیت کربنهای 9و12 از طرف دم دارد .

دو ایزومر فعال CLA پیوندهایی در Trans-11.cis-9 و trans-10 و cis-12 دارد.

CLA شامل اثرات بیولوژیکی فراوانی است . مطالعات در جانوران و انسان ها نشان داده است که جایگزینی CLA باعث کاهش چربی بدن و افزایش مقدار عضلات کم چرب می شود. افزایش عضلات کم چرب ، یکی از بارزترین ویژگی های افراد ورزشکار است . CLA توانایی سلولهای چربی را برای بالا بردن چربی خون کاهش می دهد و مانع از تشکیل سلول های چربی  می شود. اسید لینولئیک مزدوج نیز به سوختن چربی ها تا حد زیادی کمک نموده و این امر منجر به کاهش چربی و افزایش مقدار ماهیچه ها می گردد

(Blankson,H.,et al.,2002) .

CLA در درجه اول یک معرف بازدارنده شیمیایی ، در جلوگیری از بیماری سرطان سینه است جنبه مثبت دیگری از CLA ، تاثیر بر متابولیسم چربیها است . محققان با تحقیقات انجام شده در موش های صحرایی دریافته اند که CLA در رژیم غذایی ، غلظت چربیهای کبد را از طریق پایین آوردن سنتز تری گلیسریدها و افزایش اکسیداسیون اسیدهای چرب کاهش داده است .

(rahman,S.M.,et al.,2002)

مغز یکی از اندام هایی است که نیاز به اسید چرب غیر اشباع امگا- 3 دارد . بافت این اندام به ویژه غنی از DHA است ، که ارتباط نزدیکی بین مصرف این اسید چرب و رسوباتش در غشاء سلولی نشان می دهد .

(rapoport,S.I.,et al.,2001)

با توجه به اثرات مفید و سودمند  و  توصیه می شود مادران آینده ، ماهی را در رژیم غذایی شان به عنوان منبعی از اسیدهای چرب غیراشباع وارد نمایند .Koletzko,B.,et al.,2001)) . دو کوزاهگزاانوئیک اسید (DHA ) اسید چربی است که بافت مغز انسان را تشکیل می دهد وبخصوص در ماده خاکستری مغز و شبکیه چشم و در غشاء بافتهای عصبی به وفور یافت می شود و کمبود آن با بیماری های عصبی شامل حواس پرتی ، افسردگی و کم عقلی همراه است .

DHA بویژه برای کودکان وجنین حائز اهمیت است . DHA موجود در ماهی و اندامهای گوشتی جانوران توسط فیتوپلانکتون ها در دریا تولید می شود. [38]

خوردن ماهی یک یا دوبار در هفته خطر ابتلا به بیماری های قلبی را نسبت به افرادی که ماهی مصرف نمی کنند به میزان 50% کاهش می دهد .[39]

تحقیقات اخیر نشان داده است که مصرف روغن ماهی اثرات مفیدی در بیماری رماتیسم و التهاب مفاصل دارد، که این موضوع شاهدی بر این مدعاست که موجود در ماهی خواص ضد التهابی دارد. [40]

اسیدهای چرب امگا-3 برای سلامتی انسان بسیار مفید است ، همچنین برای توسعه و عملکرد ارگانهای اصلی و عکس العمل فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جانداران ضروری می باشد .

(Meyer, B, J., et al., 1999)

مصرف 5/5 گرم از امگا-3 در هر ماه خطر ابتلا به بیماری های قبلی و عروقی را 50% کاهش می دهد و از بروز سرطان جلوگیری می کند . [41]

محققان دانمارکی گزارش کردند که زنانی که از ماهی یا غذاهای دریایی هفته ای یک بار استفاده می کنند در شانزده هفته اول بارداری، خط به دنیا آوردن نوزدانی با وزن کمتر از 2500گرم  در آنان ، 6/3 بار کمتر از زنانی است که ماهی یا غذاهای دریایی استفاده نمی کنند .

(olsen,et al.,2002)

Whelton و همکارانش به اتفاق He و همکارانش نشان دادند که خطر ابتلا به بیماری های قلبی – عروقی در افرادی که یکبار در هفته ماهی مصرف می کنند 15% کمتر از افرادی است که یکبار در ماه ماهی مصرف می کنند. [42]

طی مطالعات انجام گرفته مظفریان و همکارانش نشان دادند که مزایا و فواید مصرف ماهی بستگی به نوع گوشت و محتویات  آن دارد . مصرف ماهی تن یا ماهی کبابی یا پخته در ارتباط با کاهش خطر بیماریهای قلبی – عروقی و آریتمی می باشد ، اما مصرف ماهی سرخ کرده خطر ابتلا به بیماری قلبی- عروقی را افزایش می دهد همچنین خطر ابتلا به آریتمی قلبی در افرادی که 1-4 بار در هفته ماهی مصرف می نمایند ، 28% کمتر از افرادی هست که یکبار در ماه ماهی می خورند .

(Mozaffarian, D.,et al.,2003)

شناسایی و جداسازی DHA,EPA موجود در جلبک ها که پیش از آن در ماهی کشف گردیده بود توسط J.suhimoto در سال 1925 انجام گردید [1] .

در اوایل دهه 1950 مطالعات بر روی تاثیر اسیدهای چرب بر روی کلسترول پلاسمای خون به صورت گسترده ای آغاز گردید .

دو دانشمند کانادایی به نامهای William j.Dyer , E.graham Bligh در سال 1959 از موسسه تحقیقات دریایی و ماهیگیری هالیفاکس با هدف تعیین تاثیر انجماد ماهی بر میزان کیفیت چربی ها و مواد طبیعی موجود در آن منجر به ایجاد روشی ساده ، سریع و دقیق برای استخراج ترکیبات طبیعی ماهی گردید که به نام روش Bligh and Dyer شهرت یافت . این روش در ابتدا بر روی بافت عضله مورد استفاده قرار گرفت ، ولی پس از آن برای استفاده بر روی سایر بافت ها نیز با موفقیت بکار گرفته شد. [20]

در مورد میزان انباشتگی چربی در قسمت های مختلف بدن ماهی برای نخستین بار تحقیقاتی توسط Standby انجام گردید [29]. بر اساس یافته های او قسمتهای شکمی و سرحاوی چربی بیشتری نسبت به بخشهای انتهایی ( دمی ) هستند .

Ackman و همکارانش در سال 1975 با رویکردی مقایسه ای به بررسی اسیدهای چرب دو گونه ماهی پرداختند. همچنین این دانشمند در سال 1988 به بررسی میزان و نوع چربی ها و مواد پروتئینی ماهی های منطقه نوااسکوشیا ( Nova Scotia) در جنوب شرقی کانادا نیز پرداخت [17] . در سال 1975 تا 1977 دانشمند آمریکایی Exler و همکارانش با هدف یافتن تاثیر جغرافیایی محل زندگی و محل صید ماهی بر میزان چربی موجود در ماهی ها به بررسی ترکیبات طبیعی موجود در یازده گونه ماهی های مختلف پرداختند .

Hearn و همکارانش در آمریکا و در سال 1987 به بررسی چربی و اسیدهای چرب چهل و یک گونه ماهی از آبهای سواحل شرقی آمریکا پرداختند . 

Abstract:

In this investigation, the liver and muscle tissue of cynoglossus macrolepidotus were extracted for natural compounds specially fatty acids contents using the method of Bligh and dyer.

Chloroform was used as extraction solvent evaporated by rotary evaporator. The obtaining and extract was salved in n-Hexane and injected to GC-MS.

Identification of the constituents samples was made by comparison of their mass spectra and retention indices (KI) with those given in the literature and those outhentic samples.

Hexadecanoic acid (palmitic acid) (14.98 %) was the main constituent in the liver. The other main components in the liver were 9-octadecenoic acid (Oleic acid) (12.30%) ,1.3-cyclooctadiene (7.97%) ,octadecenoic acid (stearic acid) (6.80 %) ,methyleicosa -5,8,11,14,17-pentaenoate (6.45%) , 1,4,8- dodecatriene (5.75%),9-hexadecenoic acid"(5.39%) ,5,8,11,14-Eicosatetraenoic acid ,ethyl ester(4.08%),heptacosane (1.77%) ,3-Heptadecen-5 -yne(1.24%) , tetradecanoic acid (my ristic acid) (0.66%).

Also hexadecanoic acid (palmitic acid) (43.15%) was the main constituent in the muscle. The other main components in the muscle were methyl eicosa-5,8,11,14,17-pentanoate (23.51%),octadecenoic acid (stearic acid) (8.35%) , nonane (6.74%),decane(3.06%),9-octadecenoic acid (oleic acid) (0.68%).

Key words:

polyunsaturated fatty acids ,Fish oil liver and muscle ,Largescale Tonguesole  , Palmitic Acid, Oleic Acid