مقدمه :
کشت بافت گیاهی بطور خلاصه شامل کشت پروتوپلاست ,سلول,بافت و اندام گیاهی است. در همه این کشتها, رشد ماده گیاهی عاری از میکروب در یک محیط سترون مثل محیط کشت مغذی سترون در یک لوله آزمایش صورت می گیرد.در سال های اخیر, تکنیک های کشت بافت گیاهی به یک ابزار خیلی قوی برای تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی زیادی تبدیل شده اند. این تکنولوژی با پژوهش گتلیب هابرلنت(Gottlieb Haberlandt) در مورد پر توانی سلول در اوایل قرن 20 شروع شد.وی با توجه به این نکته که با دستکاری محیط کشت سلولها , سلولهای کشت شده مراحل نموی یک رشد عادی را تکرار خواهند نمود , پیشنهاد گسترش تکنیک های جداسازی و کشت بافت های گیاهی را ارائه داد.
کشت اکسین ها توسط ونت Wentو همکاران و کشف سیتوکنین ها توسط اسکوگSkoog و همکاران, قبل از اولین کشت موفق بافت های گیاهی در آزمایشگاه صورت گرفت (گاتریت,1934 : نوبکورت , 1939).
اولین کشت موفق کالوس هویج و توتون توسط وایتWhite(1943)گزارش گردید. اسکوگ و میلر Miler(1957)گزارش کردند که اثر متقابل کمی بین اکسین ها و سیتوکنین ها نوع رشد و ریخت زایی گیاه را تعیین میکند. مطالعات آنها بر روی توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکنین, ریشه زایی را تحریک نموده و پایین بودن این نسبت, باعث تحریک تشکیل اندام هوایی می شود اما این پاسخ, عمومی نیست. با این که دستکاری نسبت اکسین و سیتوکنین در ریخت زایی گونه های زیادی موفقیت آمیز بوده است, اما امروزه واضح است که عوامل زیاد دیگری بر توانایی سلولها در کشت برای تمایز ریشه, اندام هوایی و یا رویان موثر هستند.
ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی از کار اولیه مورلMorel(1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت و تهیه یک محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک های معدنی توسط موراشیکMurashige و اسکوت(1962)ناشی شد. از آن به بعد, این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت و امروزه یک نقش کلیدی در تکثیر, اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می کند.
کشت بافت های گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است :
1- پر توانی Totipotency, که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است . پر توانی بر این مطلب دلالت می کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می باشد. گرچه از لحاظ نظری همه سلولهای گیاهی پر توان هستند, با این حال سلولهای مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند .
2- تمایز زداییDedifferentiation , که توان سلولهای بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلولها با باز تمایزیRedifferentiation اندام های جدیدی را سازماندهی می کنند .
3- شایستگی Competency , که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می کند. برای مثال , سلول های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان های کاملا فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح , واژه ناشا یستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می شود.
انواع کشت درون شیشه ای :
1- کشت گیاهان کامل ( برای مثال: کشت بذر ارکیده , کشت دانه رست Seedling)
2- کشت رویان (برای مثال : کشت رویان نارس )
3- کشت اندام ( برای مثال : کشت مریستم )
کشت شاخساره Shoot tip
کشت ریشه
کشت برگ
کشت بساک
4- کشت کالوس
5- کشت معلق و کشت سلولهای منفرد
6- کشت پروتوپلاست
کاربردهای کشت بافت گیاهی :
عمومی ترین دلایل بکارگیری تکنیک های درون شیشه ای برای تولید گیاه در جدول -2 خلاصه شده است اما مهم ترین کاربرد آن در این قرن,استفاده از تکنولوژی ژن برای بهبود محصولات است. اهمیت گیاهان برای بشر بر کسی پوشیده نیست. ما به گیاهان برای غذا, فیبر, سوخت, دارو و مسکن وابسته ایم .
بنابراین, جای تعجب نیست که بیشتر فعالیت بشر در جهت افزایش و تولید گیاهی با خصوصیات مفید متمرکز می شود.
روش های مرسوم برای اصلاح گیاهان زیاد بررسی شده اند. اما این روش ها محدودیت هایی دارند. پیشرفت قابل توجه در دانش ما از مکانیسم های ملکولی و سلولی که فعالیت ها و اعمال سیستم های زنده را پشتیبانی می کنند ما قادر به توسعه روش های جدید در بهبود گیاهان نموده است. این تکنیک ها بر روی کاربرد زیست شناسی ملکولی و سلولی تاکید می کنند. سهم بیوتکنولوژی گیاهی از طریق دست ورزی ژن فقط محدود به افزایش عملکرد محصولات یا تولید وسایلی برای پیشگیری از آسیب آفات و امراض نمی شود , بلکه ما را در افزایش کیفیت غذا و روش استفاده از زمین یاری می دهد . بنابراین , بیوتکنولوژی گیاهی توانایی قابل توجهی برای رشد و افزایش کیفیت زندگی و سلامتی بیوسفر دارد.
تکثیر کلونی سریع و در مقیاس وسیع گیاهان یکسان از یک منبع گیاهی برتر
حذف عوامل بیماری زا , همچنین تسهیل انتقال ماده گیاهی از راه مرزهای بین المللی.
تهیه منابع عاری از بیماری به صورت کشت درون شیشه ای .
ذخیره ژرم پلاسم و ذخیره بلند مدت منابع گیاهی.
گزینش جهش یافته ها از جهش های خود بخودی یا القایی.
تولید ریز قلمه های ریشه دار شده در گونه های زینتی چوبی سر سخت.
باز یابی دو رگها از گونه های ناسازگار توسط کشت رویان یا تخمک.
تولید گیاهان هاپلوئید از راه کشت بساک. گیاهان هاپلوئید ممکن است برای بازیابی جهش های مغلوب در برنامه های اصلاحی استفاده شوند. باز زایی متوالی, باعث تولید هاپلوئیدهای مضاعف شده هموزیگوس شده و بنابراین لاین های اصلاحی خالص فراهم می شوند.
روش های سترون سازی :
اهمیت موضوع رعایت شرایط استریل در طی انجام کشت بافت های گیاهی به قدری واضح است که تاکید بر آن توضیح واضحات است.
با رعایت چند مورد احتیاطی ساده می توان ضمن جلوگیری از آلودگی میکروبی محیط از هدر رفتن اوقات پر ارزش مصرف شده در آزمایشگاه به منظور تکرار کشت های آلوده شده ممانعت به عمل آورد.
در انتخاب محل اتاق کار سترون مهم ترین موضوع منحصر به فردی که باید دقیقا مورد توجه قرار گرفته شده باشد جلوگیری از جریان یافتن هوای معمولی بر روی محل کار استریل شده می باشد , زیرا جریان هوا با انتقال دادن اسپورها و ارگانیسم های آلوده کننده به اتاق کار سبب ایجاد آلودگی در کشتها می شود. اختصاص دادن یک اتاق کوچک اندرونی, اتاقی شبیه تاریکخانه عکاسی, به عنوان اتاق کار سترون شده روش بسیار مطلوبی است.
در این قبیل اتاقکها معمولا به منظور انهدام اجرام میکروبی موجود در هوا و سترون کردن سطوح داخلی اتاقک لامپ میکروب کش تولید کننده اشعه ماورا بنفش نصب می شود. اشعه این لامپ ها (که طول موج آن 253.7 نانومتر است) اجرام میکروبی را به آهستگی منهدم می کند, ولی بدلیل عدم نفوذ تشعشعات این لامپ ها به قسمت های عمقی و قسمت های گرد گرفته و سایه گیر اتاقک کار اجرام میکروبی این قسمتها از گزند این اشعه مصون می مانند. بهمین دلیل اگر چه استعمال این لامپ در اتاقک های کار کاملا مرسوم است, ولی تاثیر قطعی آن در ایجاد محیط کاملا عاری از میکروب مورد شک و تردید می باشد (18, و 11). عمر لامپ های ما وراء بنفش نسبتا کوتاه است . البته پس از متوقف شدن تولی اشعه ما وراء بنفش در طول موج 253.7 نانومتر این لامپ ها برای مدتی به تولید نور مرئی ادامه می دهند. در صورت وجود ابزار پلاستیکی در اتاقک کار از روشن کردن لامپ اشعه ما وراء بنفش خودداری نمود. ضمنا ادعا شده است که این لامپ ها ممکن است باعث تولید شدن مواد بازدارنده رشد در مدیوم کشت شوند. خلاصه اینکه استفاده از این گونه لامپ های میکروب کش باید بحداقل ممکن کاهش داده شده و نباید بسهولت جایگزین سایر روشهای سترون سازی شوند. کابینت های رومیزی مجهز به جریان هوای سترون شده بنحوی طراحی شده اند که در آنها جریان ملایمی از هوای الترافیلتره و سترون شده بطور مداوم از روی میز کار عبور داده می شود تا میزان تماس هوای معمولی آلوده به اجرام میکروبی با مواد و ابزار کشت بحداقل مقدار ممکن کاهش داده شود. به هنگام روشن کردن چراغ الکلی در داخل این قبیل کابینت ها باید موارد احتیاط رعایت شوند, زیرا که الکل به شدت آتش گیر است و جریان هوای داخل کابینت ممکن است شعله های آتش را به سمت محقق هدایت کند. ضمنا در حین انجام کشت پس از فرو برده شدن ابزار کار به داخل شیشه محتوی الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ابتدا باید با استفاده از کاغذ صافی استریل الکل اضافی آنها گرفته شده و سپس آنها برروی شعله چراغ الکلی گرفته شوند. قبل از شروع عملیات سترون نیاز میز کار باید با حوله کاغذی آغشته به الکل اتانول و یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ضدعفونی شود. یکی دیگر از مسائل مبتلا به فعالیت های سترون نیاز و عمده ترین منبع آلودگی کشتها کثیف بودن دستهای محقق است. برای انجام دادن عملیات سترون نیاز شستشوی معمولی دستها با آب کافی نیست , بلکه ضروری است دستها تا آرنج بشدت و به مدت چندین دقیقه با آب گرم فراوان و صابون شستشو داده شوند. دستها را پس از شستشو و خشک کردن باید با محلول خیلی رقیق الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول ضدعفونی نمود.
(نمودار و جداول در فایل اصلی موجود است)